荧光定量检测试剂盒(染料法)

产品货号：

WH0110

中文名称：

荧光定量检测试剂盒(染料法)

英文名称：

2×QuantSmart SYBR qPCR Mix

产品规格：

125T|500T|5000T

发货周期：

1～3天

产品价格：

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本制品是采用SYBR Green I嵌合荧光法进行Real-Time PCR的专用试剂，可对目标DNA进行快速、特异性的定量检测。优化的预混液可缩短Real-Time PCR的反应时间，适用于标准或快速PCR仪。

2×QuantSmart SYBR qPCR Mix采用了抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶，配合独特的qPCR Buffer体系可确保本制品在所有的Real-Time PCR仪上进行高灵敏的快速qPCR反应，qPCR反应时间可缩短50%。此外，Buffer中添加了的H-Competitor因子和EP组分，还使得本制品具有广泛的样本普适性，对具有复杂高级结构的模板、PCR抑制剂残留较多的模板以及长片段扩增等具有非常好的适用性。同时本制品还具有高扩增效率，高扩增特异性和宽广的可信范围等特点，在不影响PCR效果的前提下更快获得结果，节约科研时间和能源。

2×QuantSmart SYBR qPCR Mix采用了抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶，配合特制的快速qPCR Buffer体系，可大大缩短变性、退火与延伸时间，可节省多达50%的反应时间，快速获得实验结果。
本制品中特别添加了H-Competitor因子，能够竞争氢键、增强双链的打开强度，使本制品具有广泛的样本普适性，对具有复杂高级结构的模板和长片段扩增等具有非常好的适用性。
本制品特制的快速PCR Buffer体系含有独特的PCR稳定因子——EP，能够有效的保护酶活，抵御各种PCR抑制剂的干扰，保证了2×QuantSmart SYBR qPCR Mix高扩增效率，高扩增特异性、高扩增灵敏度和宽广的可信范围的特点。
2×QuantSmart SYBR qPCR Mix中预混有SYBR Green I，PCR反应液配制时，只需加入模板、引物、灭菌蒸馏水便可进行快速Real-Time PCR反应，操作简单方便。
本制品附带ROX Reference Dye，用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差，方便客户针对不同型号荧光定量PCR仪时选择对应浓度使用。
2×QuantSmart SYBR qPCR Mix采用无色透明管包装，经检测，光照不会影响体系的定量的结果。

本制品采用了特异的抗体修饰热启动DNA聚合酶进行快速PCR扩增，通过检测反应进程中SYBR Green I的荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的，适用于标准和快速PCR仪。

本制品中特异的抗体修饰热启动DNA聚合酶，95℃条件下孵育3min即可激活全部酶活，在缩短变性时间的同时避免了非特异性产物的扩增，可大大缩短变性、退火和延伸时间，使PCR总运行时间缩短50%，更快获得实验结果，而不影响PCR反应效果。
本制品的快速PCR Buffer体系添加了独特的H-Competitor因子和EP组分，配合精心优化的快速PCR Buffer体系，对具有复杂高级结构的模板、PCR抑制剂残留较多的模板以及长片段扩增等具有非常好的适用性。
本制品针对cDNA模板和gDNA模板结构组成的差异，对PCR的体系反应步骤进行了特别的优化，使较难扩增的gDNA模板也能获得良好的PCR结果。

组分	125T	500T	5000T
2×QuantSmart SYBR qPCR Mix	1.25mL	4×1.25mL	40×1.25mL
50×ROX Reference Dye	250μL	1mL	10×1mL
RNase-Free ddH2O	2×1mL	5×1mL	50×1mL

保存：-20℃，避光，有效期2年。

保存事项

收到本制品后，请立即置于-20℃避光保存。从-20℃取出使用时，将冻存的2×QuantSmart SYBR qPCR Mix和ROX Reference Dye融解，然后轻轻颠倒混匀，待溶液完全均一后再行使用。如解冻后没有使用，须彻底混匀后重新冷冻。（在解冻过程中盐会出现分层现象，未混匀进行冷冻，盐晶体的析出将会对酶造成损害)。如需一段时间内经常取用，可在2～8℃条件下储存3个月。避免反复多次冻融。

如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。使用时请上下颠倒轻轻混匀，请不要使用振荡器进行混匀，尽量避免出现泡沫，并经瞬时离心后使用。
引物纯度对反应特异性影响很大，建议使用PAGE级别以上纯化的引物。
引物终浓度为0.3μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。如果需要进一步优化，可以在0.2～0.5μM范围内调整引物浓度。
20μL反应体系中，cDNA模板的使用量一般小于100ng，基因组DNA模板量一般小于50ng，逆转录产物作为模板时，使用量应不超过PCR体系终体积的20%。

一、建立Real-Time PCR反应体系：

融解2×QuantSmart SYBR qPCR Mix、ROX Reference Dye、模板、引物和RNase-Free ddH2O，并将所有试剂在室温下溶解并彻底混匀。

建议置于冰上进行Real-Time PCR反应液的配制。反应体系如下：

成分	50μL体系	25μL体系	20μL体系	终浓度
2×QuantSmart SYBR qPCR Mix	25μL	12.5μL	10μL	1×
正向引物（10μM）	1.5μL	0.75μL	0.6μL	0.3μM^①
反向引物（10μM）	1.5μL	0.75μL	0.6μL	0.3μM^①
cDNA模板	－	－	－	－
50×ROX Reference Dye^②	－	－	－	－
RNase-Free ddH2O	至50μL	至25μL	至20μL	－

注^①：引物终浓度为0.3μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。扩增效率不高时，可增加PCR反应体系中的引物浓度；发生非特异扩增时，可适当减少PCR反应体系中的引物浓度。需要进一步优化引物浓度的，可以在0.2～0.5μM范围内调整。
注^②：几种常见仪器的最适ROX Reference Dye浓度如下：
ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT/Step One等：5×（例如：5μL ROX/50μL体系)；
ABI 7500、7500 Fast、ViiA 7；Stratagene Mx3000P、Mx3005P和Mx4000等：1×（例如：1μL ROX/50μL体系)；
Roche仪器，Bio-Rad仪器，Eppendorf仪器等：无需添加。

二、进行Real time PCR反应：

建议采用两步法PCR反应程序进行反应；若模板量较低等因素导致扩增效果不佳，可使用三步法程序进行PCR反应。
两步法反应程序：

阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
预变性	1×	95℃	3min	预变性	否
PCR反应	40×	95℃	5sec	变性	否
PCR反应	40×	60℃^③	15sec^④	退火/延伸	是
熔解曲线分析（Melting/Dissociation Curve Stage）

三步法反应程序：

阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
预变性	1×	95℃	3min	预变性	否
PCR反应	40×	95℃	5sec	变性	否
		50～60℃^⑤	10sec	退火	否
		72℃	15sec^④	延伸	是
熔解曲线分析（Melting/Dissociation Curve Stage）

注^③：请先使用60℃ 15sec进行扩增。如果需要进一步优化，可以尝试在56～66℃范围内进行。
注^④：使用不同型号仪器进行时间设定时，请按照仪器使用说明书要求进行实验操作，几种常见仪器的时间设定如下：
使用ABI 7700/7900HT/7500 Fast/ViiA 7，Roche，BioRad和Agilent等公司荧光定量PCR仪时，请设定在15sec。
使用ABI 7000和7300时请设定在31sec。
使用ABI7500时请设定在32sec。
注^⑤：通常引物退火温度比引物的解链温度（Tm)低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度。

盖上反应管，轻柔混匀。可短暂离心，确保所有组分均在管底。
将反应体系置于荧光定量PCR仪中，开始反应。

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